Множество писем по поводу возможности клонирования в квартирных условиях заставили меня написать эту статью.
Да, теоретически это возможно.
(Мы, конечно же, имеем для этого спецоборудование.)
Данная статья рассчитана на простых людей, не имеющих спецобразования,
поэтому писать буду простым языком, без применения специальных терминов.
Научных работников лабораторий по размножению in vitro прошу отнестись к ней лояльно.
Прежде всего, разберемся во всех плюсах и минусах микроклонального размножения.
Минусы:
Качественный процесс, если соблюдать все правила, - очень дорогое удовольствие.
Поэтому, выгодно это только в очень большом количестве - десятки тысяч и более.
Мало кто в нашей стране в это хочет вкладывать десятки тысяч долларов.
Именно поэтому, мы имеем дело часто с некачественным посадочным
материалом. Растения плохо переносят адаптацию, химеры спортуют, и т.д.
При размножении же традиционным способом, слабые растения просто
погибают, а выживают сильнейшие.
Плюсы:
При соблюдении всех
тонкостей, при микроклональном размножении можно получать любое
количество одинаково очень качественного посадочного материала, что не
возможно при традиционном размножении. В дальнейшем после адаптации,
качественно клонированные растения опережают в своем развитии своих
братьев, выращенных традиционным способом.
Если у Вас есть
свободное время и желание попробовать, то я опишу первый, на мой
взгляд, самый главный этап этого процесса. Клонировать будем
фаленопсис. Так как питательная среда содержит все необходимое для
размножения не только нужной для нас культуры, но и для всевозможных
грибков, бактерий, летающих в воздухе и находящихся на самом растении,
нужно пройти этап получения стерильной культуры.
Как только Вы получите стерильный, жизнеспособный материал, дальше множить его - дело техники.
Для начала, Вы должны найти подходящее помещение. Например, подойдет
ванная комната, облицованная кафельной плиткой. Моете ее всю с
применением дезинфицирующего средства. Предварительно покупаете в
медтехнике кварцевую лампу 400вт.(50-100гривен), подключаете ее к
обыкновенному дросселю(40-80грн.) Кварцуете комнату 2- 4 часа.
Покупаете ватно-марлевую повязку, халат, шапочку. Проглаживаете все эти
вещи и вешаете в комнате перед кварцеванием. Все вспомогательные вещи,
кроме, конечно, растений, заносятся в комнату перед кварцеванием. Любая
малейшая пылинка, попавшая в стерильную пробирку с питательной смесью,
вырастет в большую плесень. Поэтому хочу обратить Ваше внимание на
ответственность этого этапа. Естественно, нужно заклеить все
вентиляционные отверстия. Далее Вам понадобятся пинцет, скальпель,
стерильные салфетки (их должно быть не менее 10), на которых вы будете
подрезать цветоносы. Пустые банки, фольга, инструменты стерилизуются в
духовке при температуре не ниже 200 градусов 2 часа. В качестве
салфеток подойдут льняные лоскутки размером 20 на 20 см. Заворачиваете
в пищевую фольгу, все по отдельности, и прожигаете в духовке при
температуре 150 градусов 3 часа (подберите сами максимальную
температуру, чтобы они не сгорели).
Покупаете в аптеке
дистиллированную воду, разливаете в предварительно стерилизованные в
духовке 200 граммовые банки. Закрываете банки прожженной фольгой и
стерилизуете, можно в духовке, скороварке, микроволновке (фольгу
заменить бумагой). Далее готовите стерилизационный раствор. Подойдет
обыкновенная хлорка. Разводите ее 10гр на 100 мл дистиллированной воды.
Моете цветоносы в проточной воде с хозяйственным мылом.
Вот минимум предварительных работ.
Выключаете
кварцевую лампу (обгореть можно за 10 минут), заходите в комнату,
заносите цветоносы, переодеваетесь (надеваете халат, шапочку,
ватно-марлевую повязку), протираете руки и стол, на котором будете
работать, спиртом. Никаких резких движений.
Расставляете перед собой
банку со стерилизующим раствором и три банки со стерилизованным
дистиллятом. Опускаете цветоносы в первую банку. Вынимаете стерильным
пинцетом первый цветонос через 6 минут, второй через 8 и т.д.,
последний через 20 минут. Опускаете сразу после первой банки в
дистиллят. Вымачиваете цветоносы 10 минут. Пинцет и скальпель
стерилизуете в пламени спиртовки и даете им остыть перед каждым
последующем использованием. Опускаете цветоносы в следующую банку с
дистиллятом. Затем, также в третью. Это необходимо для удаления
остатков хлорки. Разворачиваете фольгу с салфетками и кладете на нее
один цветонос. Обрезаете цветонос прожженным скальпелем. Оставляете
внизу под спящей почкой 5мм., выше - 3 мм. Открываете пробирку с
питательной смесью (покупаете у меня - 2 гривны штука), сажаете туда
цветонос, чтобы спящие почки были над поверхностью, закрываете фольгой.
И так далее с каждым цветоносом, меняя салфетки и стерилизуя
инструменты. ВСЕ.
Ставите пробирки с цветоносами на полки.
Температура 25-28 градусов. Продолжительность светового дня примерно 16
часов. Влажность 70%. Если в пробирках через две недели не поросло
плесенью, то Вы достерилизовали. Если через месяц (максимум 1,5 месяца)
почки не проснулись, то Вы перестерилизовали. Из спящих почек, при
соблюдении температурного режима, вырастут несколько маленьких розеток,
которые в дальнейшем Вы и будете клонировать.
Ну как, Вам еще хочется попробовать этим заняться?
Если Вы осилите этот этап, то следующие тем более.
Многих интересует возможность размножения растений in vitro в домашних условиях. Насколько это возможно вы узнаете из этой статьи. Она будет написана на доступном языке, для непосвященных людей.
Для хорошего результата нужно учитывать все правила процедуры. Это увеличивает затраты и выгода будет, только если размножать в достаточно больших количествах.
При размножении путем in vitro посадочный материал выходит достаточно качественный.
Растения лучше адаптируются и бистро развиваются. Имеют сильный иммунитет к заболеваниям.
Начинать клонирование нужно с полной стерилизации как среды, растительного материала, инструментов. Помещение моется дезинфицированными средствами. Желательно чтоб стены были обложены кафелем, что облегчает процедуру. Несколько часов обрабатывается комната кварцевой лампой. Приобретается медицинский комплект в виде халата, шапочки и марлевой повязки. Спецодежда обрабатывается горячим утюгом и кварцуется в той же комнате. Все необходимые инструменты разлаживаются в комнате в момент кварцевания. В обязательном порядке заклеиваются все отверстия, включая вентиляционные. Любая бактерия или микроб попавшая на растение загубит всю операцию.
Вам понадобятся инструмент для разрезания, его лезвие должно быть очень острым и тонким. Чистые емкости и льняные тряпочки, завернутые в фольгу, стерилизуются 1-2 часа при высокой температуре не ниже 200 С, в духовке. Таким же образом стерилизуете дистиллированную воду.
Теперь необходимо обработать растительный материал. Промывается под проточной водой с хозяйственным мылом.
Разводится на 100 мл воды 10 гр. хлорки, это будет дезинфицирующий раствор.
Начинаете работать в комнате с включенной кварцевой лампой. Там же и переодеваетесь в спец одежду. Затем обрабатываете руки и рабочее место спиртом.
На стол ставите три банки со стерильной водой и одну с хлор раствором.
Растительный материал окунаете в раствор. Пинцетом вынимаете один фрагмент через 5 минут, второй через 8, третий через 20 минут. Пинцет после каждого применения накаливайте на огне. Опускаете фрагмент растения в банку с водой на 10 минут. Затем в последующие, для удаления остатков хлора.
На тряпку предварительно обработанную ложится растительный материал. Острым, тонким предметом (скальпель) обожженным над огнем отрезается почка. Под почкой оставляется 5 мм, нал 3 мм. Берете пробирку со специальной смесью и помещаете туда почку. Пробирка герметично закрывается фольгой. Такую операцию проделываете с остальными фрагментами. Не забывайте менять тряпочки и обжигать инструменты после каждого применения.
Теперь пробирки хранятся на полке. Соблюдается 16 часовой световой режим, высокая 70 % влажность. Температура достаточно высокая - 24-28оС. Важно не убить стерилизацией растительный материал, но при этом уничтожить вредоносные бактерии и микробы. В случае правильно проведенной процедуры через месяц появятся крошечные росточки.
Процесс in vitro достаточно щепетилен и требует больших затрат физических ресурсов. Малейший недочет и вся операция будет проведена безуспешно.
Мы создали собственную лабораторию и освоили технологию производства элитного посадочного материала голубики высокорослой , ежевики , жимолости съедобной , малины, брусники.
Культура in vitro – выращивание клеток, тканей, органов на искусственной питательной среде в абсолютно стерильных условиях при контролируемых физических факторах (свет, температура, влажность, фотопериодичность).
Микроклональное размножение – разновидность вегетативного размножения растений в культуре in vitro. Оно освоено на явлении тотипотентности (способность нести и восстанавливать генетическую информацию растений).
Исходным материалом для введения растений в культуру обычно служат элитные растения, типичные для сорта и без признаков инфекции.
По вопросам IN-VITRO и для заказа саженцев — звоните или приезжайте .
Размножение растений в культурах ин-витро (микроразмножение) означает способ размножения в искусственных, асептических условиях (в стекле). Представления микроразмножения является теория заложенная, когда каждая клетка растения покрытосеменных скрывает переданные через ядро и цитоплазму свойства, которые в определенных условиях делает возможным восстановление целого организма, отвечающему целому материнскому растению. Размножение ин-витро растений садовых, древесных, проходит примерно как растений зеленых, однако достижение свойств размножение является более сложным. В процессе розмнажения можно выделить четыре этапа.
Материалом для размножения, используются растения свободные от болезней, зачастую с помощью термотерапии, после зимнего отдыха берут верхушечный побег растения. Стерилизацию поверхности проводят с помощью смеси из (50% алкоголя и 0,1% хлорки (хлорид ртути)). Для размножения используют верхушечный побег 0,3-0,8 мм, для смеси чаще всего используют работы Мурашига и Кога, с добавлением цитокинина BAP (бензиламинопурина), стимулятора роста и образователя новых побегов. В первом этапе растения содержаться 3-4 недели, создаются несколько дополнительных побегов. Состав Мурашига и Кога таков: (в мг/л)
Субтракция пробуждает рост и образование боковых побегов. Для получения хороших приростов размножения нужно использовать хорошие термично-освещенные условия. Интенсивность осветления должна быть около 1000 люксов (1000 люмий на квадратный метр), а температура воздуха от 21 до 25 градусов Цельсия . Температура выше 30 гр приводит к быстому старению материала и уменьшению продуктивности.
Для укоренения в пробирках используют молодое растения с хорошо образовавшимися листьями, длиной около 2 см. Для укоренения используют стимуляторы корнеобразования на основе ауксина.
Типы использования различных ауксинов (NAA, IAA или IBA) считается самым лучшим раствором с содержанием от 0,5 до 2 мг на литр раствора. Перебор укоренителя вызывает образование калиуса и затруднение образование корней. Хорошему укоренению растений способствует интенсивность света и уменьшение минеральных солей, добавление витаминов, B1, B2, B6, кислоты никотиновой и аскорбиновой.
Размножение растений в ин-витро, есть в практике несколько десятков лет. Большое значение в этом способе является быстрое размножение растений за короткое время, а также выращивание их без вирусов. С одной почки растения можно вырастить несколько тысяч растений.
Для того чтобы получить копию растения с максимальной похожестью свойств желательно такое растение размножать не генеративно, т.е. семенами, а вегетативно, т.е. частями самого растения. Такими частями могут быть черенки, корневые деленки, подземные и боковые побеги, дочерние луковицы, усы и т.п. Растения, полученные таким способом — генетически идентичны исходному экземпляру. Они называются его клонами, а размножение растений такими способами — называются клонированием этого растения. Клонирование – доступный каждому способ размножения растений, не имеющий отношения к генной инженерии, а полученные таким способом растения не являются ГМО. При клонировании стоит задача получить растение с сохранённым генотипом, а не модифицировать его.
За счёт капиллярности вещества из питательной среды начинают поступать к клеткам меристемы. Клетки начинают делиться и расти и, соответственно, начинает расти наш микроскопический срез меристемы. По мере роста он превращается в миниатюрное растение, которое генетически идентично исходному растению, с верхушечной точки которого брали срез. У растения образуются точка роста, листья, ствол, корень, закладываются почки возобновления.
У учёных-биологов эта процедура называется «введение в культуру in vitro». Это означает, что растение начинает культивироваться (выращиваться при помощи человека) в стеклянной лабораторной посуде в стерильных условиях и искусственном питании. В условиях in vitro растение начинает получать всё необходимое ему для роста и развития из питательной среды. Получая сахара для питания, растение перестаёт нуждаться в их самостоятельном производстве и процессы фотосинтеза сильно замедляются. Замедлению фотосинтеза способствует обеднение воздуха внутри пробирки углекислым газом так как нет его притока кроме продуктов дыхания самого растения. Из-за такого способа питания, на который обречено растение in vitro у самого растения изменяется метаболизм, образуются изменённые и недоразвитые органы. Так 100% относительная влажность и стабильная температура не дают развиться у растения системе термо- и влаго-регуляции. Растения имеют полностью открытые устица на внутренней поверхности листьев, но они не испаряют воду из-за 100% относительной влажности. Растения не производят растительный воск, который должен был бы предохранять их от высыхания и перегрева. Корни вырастают «ленивыми». Они толстые, длинные, на них отсутствуют волосовидные корешки, которые в «обычной» жизни растения выполняют важную функцию всасывания влаги и питательных веществ из почвы.
У растений средней полосы, да и у большинства других, существует чёткая цикличность в развитии. «Дирижёром» этого развития является внешняя среда. Температура, влажность, продолжительность светового дня – все эти факторы «подсказывают» растению в какой части биологического цикла оно находится и к чему нужно готовиться. Механизм влияния прост. При воздействии внешнего фактора в растении вырабатываются определённые химические вещества, которые участвуя в обмене веществ растения, доносят указания «дирижёра» до соответствующих органов растения и запускают соответствующие внутренние биологические процессы. Такие вещества называются растительными гормонами. Растения же содержащиеся в условиях in vitro практически лишены влияния природной среды. Исключение составляет, разве что, только атмосферное давление. Поэтому для управления биологическими циклами и процессами у растений in vitro нашли очень простой способ – гормоны им добавляет в питательную среду сам человек. Получив такую гормональную команду, растение запускает требуемые нам биологические процессы. Так на определённом этапе растению добавляют в питательную среду гормон роста, и оно начинает образовывать боковые побеги. Эти побеги в стерильных условиях аккуратно срезают и помещают опять на питательную среду для укоренения и роста в стерильных условиях in vitro. Такая процедура называется «микрочеренкованием» и отличается от обычного черенкования только стерильными условиями и микроскопическим размером черенков. Следует сказать, что стерильные условия для микрочеренкования обеспечиваются в первую очередь проведением всех манипуляций в ламинарном шкафу.
После укоренения мы имеем первое поколение клонов. Для получения необходимого количества растений на выходе нужно просто провести несколько таких циклов клонирования и после каждого цикла будем получать увеличивающееся с геометрической прогрессией количество растений. Предположим, мы эти шаги проделали нужное число раз и имеем in vitro нужное нам большое количество одинаковых по размеру и генетически тождественных друг другу микроскопических растений.
Теперь перед нами стоит задача вынуть растения из пробирок и приучить их жить и развиваться вне пробирок — в обычных условиях, как говорят биологи — ex vitro. Такая процедура является обратной процедуре введения в культуру in vitro и называется адаптация. В процессе адаптации растение должно:
1. Научиться заново фотосинтезу. Т.е. уметь самостоятельно запасать для себя в нужных количествах энергию света синтезируя полисахара из воды и углекислого газа.
2. Вырастить на корнях волосовидные корешки и через них снабжать себя влагой и растворами солей из почвы.
3. Научиться сужать и вообще закрывать устица для регулирования количества испаряемой влаги с целью регулирования скорости обмена веществ и защиты от перегрева и высыхания.
4. Научиться вырабатывать растительный воск на покровных тканях для защиты от неблагоприятных факторов.
5. Подрасти и укрепиться для последующей акклиматизации.
Адаптация не менее сложный и важный процесс в размножении растений наравне с введение в культуру in vitro. Не все растения могут пройти путь от жизни в пробирке к жизни вне пробирки. Для облегчения растениям этого пути используются специальные установки, позволяющие плавно менять параметры внешней среды и защищать юные растения от быстрого заражения патогенной флорой и фауной.
Растения, прошедшие адаптацию — уникальны по своим свойствам.
Во-первых, они молоды. Биологический возраст растений размноженных in vitro начинает отсчитываться с нуля, в отличие от растений, полученных обыкновенным черенкованием, которые частично наследуют возраст маточного растения. Юные растения быстрее растут и развиваются.
Во-вторых, они абсолютно здоровы, что опять-таки хорошо сказывается на их росте, урожайности и способности хорошо размножаться вегетативно.
В-третьих, они, как говорят садоводы, корнесобственные. Это означает, что все части полученных растений генетически идентичны, что увеличивает их сортовую выживаемость. Это положительное свойство всех черенкованных растений даёт им превосходство над привитыми растениями. Последние в случае утраты надземной части и возобновления роста восстанавливаются как дички, на которые была сделана прививка. Сирень же полученная методом микрочеренкования, даже поросль будет давать сортовую.
В-четвёртых, после размножения растений in vitro укореняемость их черенков при обычном черенковании значительно увеличивается.
Продолжая перечислять положительные стороны размножения растений по технологии микрочеренкования, следует сказать, что эта технология позволяет размножать такие виды и сорта растений, которые не укореняются совсем или крайне плохо укореняются при обычном черенковании. Ещё можно заметить, что сложность и, соответственно, затратность микроклонального размножения вынуждает производителей особо тщательно выбирать сорта для массового размножения. В первую очередь для размножения in vitro отбираются особо качественные, высокодекоративные и урожайные сорта повышенного спроса.
Ввиду сказанного становится понятно, что выращиваемые нами растения по сортности являются супер-суперэлитой в агрономической терминологии. Хотя в картофелеводстве супер-суперэлитой называется семенной картофель, полученный на второй год выращивания в открытом грунте. Наши же растения после адаптации высаживаются в пластиковые контейнеры, заполненные специально подобранной грунтовой смесью на основе торфа. Превосходство технологии in vitro описывают в своей работе ученые из Института биоорганической химии РАН и РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Так приведённая ниже Таблица 1 из их работы, наглядно показывает разницу в коэффициенте размножения растений земляники, полученной in vitro и выращенной обычным способом.
| Сорт | Количество розеток от растений, полученных in vitro, шт. | Количество розеток от растений, полученных через пикеровку, шт. | ||
| Конец июня | Начало августа | Конец июня | Начало августа | |
| Ред Гонтлет (Red Gauntlet) | ||||
| Зенга Зенгана (Senga Sengana) | ||||
Выращенные в контейнерах растения можно свободно перевозить и высаживать в грунт в течение всего тёплого периода года. Состав смеси позволяет удерживать влагу продолжительное время. Но даже обильный полив перед дальней перевозкой не повредит нашему растению, так как в состав субстрата входят разрыхляющие и удерживающие воздух компоненты — корни не задохнутся. В состав субстрата также входят комплексные удобрения с микроэлементами длительного периода действия, что позволяет продолжительное время держать растение до посадки в контейнере, обходясь лишь периодическими поливами.
Автор статьи:
Диев А.Б.
Использованная литература.
1. В.Г. Лебедев, А.Б. Азарова, К.А. Шестибратов, В.И. Деменко. Проявление самоклональной изменчивости у микроразмноженных и трансгенных растений // Известия ТСХА. 2012. N1. С. 153-163.
